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    新型RNAi載體——saiRNA,更為安全的高效RNA干擾載體!

    發(fā)布時(shí)間: 2021-08-27  點(diǎn)擊次數(shù): 2435次

    RNAi 技術(shù)的前世今生 

    造物真的很神奇。生物體有很多機(jī)會(huì)被來(lái)自病毒、細(xì)菌等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)。但宿主會(huì)說(shuō),“你有張良計(jì)我有過(guò)墻梯",這個(gè)過(guò)墻梯就是 RNAi:宿主細(xì)胞會(huì)對(duì)這些外源性基因 dsRNA 隨即產(chǎn)生反應(yīng),被核酸內(nèi)切酶 Dicer 切割成小片段 RNA(即 siRNA)。siRNA 再與體內(nèi)一些酶結(jié)合形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC 與外源性基因表達(dá)的 mRNA 進(jìn)行特異性結(jié)合并將其切割,使得 mRNA 降解。然后 siRNA 還會(huì)“乘勝追擊",可作為引物與靶 RNA 結(jié)合并在 RNA 聚合酶作用下合成更多新的 dsRNA, 新合成的 dsRNA 再由 Dicer 切割產(chǎn)生大量的次級(jí) siRNA,從而使 RNAi 的作用進(jìn)一步放大,最終將靶 mRNA *降解。


    新型RNAi載體——saiRNA,更為安全的高效RNA干擾載體!

    在 RNAi 感染過(guò)程中,產(chǎn)生 dsRNA 的一個(gè)有效方法就是在體內(nèi)表達(dá)一個(gè)短發(fā)夾 RNA 分子,這種 shRNA 包含兩個(gè)短反向重復(fù)序列(其中一個(gè)與目的基因互補(bǔ)),中間由一個(gè) loop 序列分隔,組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在體內(nèi) shRNA 可以被加工 siRNA。


    傳統(tǒng) shRNA 脫靶作用大且抑制 miRNA

    大家都知道,利用生物體的 RNAi 現(xiàn)象發(fā)展出來(lái)的 RNAi 技術(shù)是目前最“喜聞樂(lè)見"的基因沉默技術(shù)。

    在科研中制備 siRNA 的方法主要有化學(xué)合成法和轉(zhuǎn)錄法。其中,轉(zhuǎn)錄法,通俗點(diǎn)說(shuō)就是“借腹生子"。就是通過(guò) DNA 載體,利用細(xì)胞內(nèi)源的 RNA 聚合酶Ⅲ(RNA PolⅢ),如 U6、H1 等 的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄表達(dá) shRNA,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的發(fā)夾狀 shRNA 可以被細(xì)胞內(nèi)源的 Dicer 蛋白識(shí)別并加工成 siRNA,然后與 Ago 蛋白結(jié)合發(fā)揮作用。將這些 shRNA 的表達(dá)框用質(zhì)?;蛘呦俨《镜劝b一下轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi),就可以實(shí)現(xiàn)在動(dòng)物整體或特定組織中沉默靶基因。

    雖然這項(xiàng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在動(dòng)物整體或特定組織中沉默靶基因,但是不可避免的是在這個(gè)過(guò)程中 siRNA 會(huì)“亂來(lái)",比如,偶爾會(huì)饑不擇食,慌不擇路地與非特異的 RNA 序列結(jié)合,把人家該正常表達(dá)的“無(wú)辜"基因沉默掉,這就是所謂的脫靶作用(off-target)。

    作為 siRNA 的前身 shRNA 也會(huì)瞎搗弄,就是對(duì)細(xì)胞內(nèi)源 miRNA 的競(jìng)爭(zhēng)抑制。由于 shRNA 的加工需要細(xì)胞內(nèi)的 Dicer、Exportin-5、Ago 等蛋白質(zhì)因子協(xié)助,而這些萬(wàn)人迷般的蛋白質(zhì)因子也是細(xì)胞內(nèi)源 miRNA 加工成熟所必須的。由于 miRNA 是細(xì)胞功能的重要調(diào)控分子,過(guò)表達(dá)的 shRNA 與內(nèi)源 miRNA 競(jìng)爭(zhēng)相同的加工機(jī)器,必然對(duì)內(nèi)源 miRNA 的表達(dá)和功能造成抑制作用。shRNA 瞎搗弄的后果可以很嚴(yán)重,比如在小鼠肝臟中長(zhǎng)期高表達(dá) shRNA 會(huì)造成嚴(yán)重的肝臟損傷并引發(fā)肝癌導(dǎo)致動(dòng)物死亡。

    因此,設(shè)計(jì)一種低毒副作用的 RNAi 載體進(jìn)行高效沉默靶基因很重要。


    saiRNA 的*性:高效率、低脫靶 

    而吳立剛研究組對(duì)具有不同莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 siRNA 前體的加工和功能進(jìn)行了深入研究,并在此基礎(chǔ)上發(fā)明了一種比傳統(tǒng) shRNA 效率更高,脫靶作用更少的新型 RNAi 載體--saiRNA(singlestrandedAgo2-processed interfering RNA)。 在 RNAi 發(fā)揮基因沉默功能的過(guò)程中,RISC 復(fù)合物是核心成分,主要由外源提供的 siRNA 與 細(xì)胞內(nèi)的 Ago 家族蛋白質(zhì)組裝形成。哺乳動(dòng)物中其蛋白家族有四成員:Ago1、2、3、4,但 只有 Ago2 是 RNAi 的“真愛",具有 RNAi 活性(切割*互補(bǔ)配對(duì) RNA 的核酸內(nèi)切酶活性), 而 Ago1、3、4 沒(méi)有 RNAi 活性卻會(huì)引起較強(qiáng)的脫靶作用。傳統(tǒng) shRNA 產(chǎn)生的 siRNA“很博愛", 能與所有 Ago 蛋白結(jié)合不同, 但吳立剛研究組發(fā)明的 saiRNA 只有與 Ago2 結(jié)合后才能被加工產(chǎn)生成熟的 siRNA,因此有效避免了與 Ago1、3、4 介導(dǎo)的脫靶作用,從而顯著增強(qiáng)了其對(duì)靶基因的沉默效率。

    新型RNAi載體——saiRNA,更為安全的高效RNA干擾載體!

    saiRNA 的“專一"還體現(xiàn)在:與 Ago2 結(jié)合后加工產(chǎn)生成熟的 siRNA,其特殊的加工方式只產(chǎn)生一條導(dǎo)向鏈(guide strand,具有基因沉默功能的 siRNA 鏈),不會(huì)產(chǎn)生 passenger strand(與 guide strand 互補(bǔ)配對(duì)的沒(méi)有基因沉默功能的 siRNA 鏈),因此也就*避免了由 passenger  strand 與 Ago 蛋白結(jié)合后產(chǎn)生的脫靶作用。

    saiRNA 的優(yōu)勢(shì)還在于對(duì)細(xì)胞內(nèi)源 miRNA 的影響小。這個(gè)邏輯有點(diǎn)繞,就是,不論是化學(xué)合成的 saiRNA,還是基于 RNA 聚合酶 III 的 DNA 表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成的 saiRNA,因?yàn)?對(duì) Ago2 的專一,其被加工后產(chǎn)生的 siRNA 的單位濃度分子對(duì)靶基因的抑制效率都高于傳統(tǒng)的 shRNA。因此,在同樣的沉默效率下,saiRNA 產(chǎn)生的成熟 siRNA 在細(xì)胞內(nèi)的積累量要遠(yuǎn)低于 shRNA,避免了占用大量 Ago 蛋白,并且其加工不需要 Dicer 等 miRNA 加工所必須的“萬(wàn)人迷"蛋白質(zhì)因子,因此不會(huì)跟細(xì)胞內(nèi)源 miRNA 爭(zhēng)搶,更不會(huì)對(duì)內(nèi)源 miRNA 的表達(dá)和功能造成抑制作用。

    所以,saiRNA 作為一種新型的 RNAi 載體,具有高效和低脫靶的特點(diǎn),通過(guò)對(duì) saiRNA 設(shè)計(jì)的繼續(xù)優(yōu)化,以及動(dòng)物整體的基因沉默實(shí)驗(yàn),將為科學(xué)研究和基因治療應(yīng)用提供更為安全高效的工具。



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